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重组蛋白纯化的标签之Avi-Tag

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  • 2018-7-26 15:32
  • medicilon 发表于 2019-9-29 15:00:07 | 显示全部楼层 |阅读模式
    借助生物素连接酶的酶催化反应来进行目的蛋白特异性生物素标记的Avi-Tag技术,是一种可以应用于蛋白固定、蛋白纯化和显影等的短肽标签。在重组蛋白制备过程中与目的蛋白融合表达的蛋白或多肽指的是蛋白标签,蛋白标签一般具有促进目的蛋白的可溶性和稳定性、便于目的蛋白被检测和蛋白表达纯化的作用。目的蛋白可以通过与Avi-Tag融合表达而实现生物素化,无论在体外或者体内,几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi-Tag位点轻易且有效地被生物素化,而且研究发现利用单抗生物素来进行Avi-Tag融合蛋白纯化比其他常用的标签技术效率要高。

    1、什么是生物素?

    广泛分布于动植物组织中的生物素是一种维持人体自然生长和正常人体机能所必须的水溶性维生素,是一种可以用于重组蛋白表达纯化的标记物,可以用于蛋白质分离、蛋白纯化和蛋白质相互作用研究。生物素也属于微生物B族,又称为维生素H、辅酶R,它是合成维生素C的必要物质,又是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质。生物素可以维持正常生长、发育及健康必要的营养素,无法经人工合成。

    生物素经活化后,可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合,形成的生物素衍生物,不仅保持了大分子物质的原有生物活性,而且具多价性。无论在体外或者体内,几乎所有的蛋白都可以在一个独特的位点轻易且有效地被生物素化。生物素通过噻吩环戊酸侧链上的羧基与多种大分子偶联活化后,可用于标记各种蛋白质(包括抗体、抗原、酶、激素及葡萄球菌A蛋白等)形成生物素化蛋白质衍生物。而且一个蛋白质分子可联结多个生物素分子,从而使其具较高的比活性,在与亲和素的反应中成为多价。

    2、Avi-Tag与生物素连接酶结合,可以用于蛋白纯化

    Avi-Tag技术指的是将目的蛋白的N端或者C端加上由15个氨基酸残基组成的小标签,该小标签可以被生物素连接酶BirA特异性识别,并在目的蛋白Avi-Tag标签上的赖氨酸残基共价结合生物素,从而实现目的蛋白的生物素化标记、纯化或者检测,这样就可以用亲和素与生物素的高特异性、高亲和力的反应对蛋白质进行研究。美迪西生物医药提供蛋白表达纯化服务,其拥有多种蛋白表达协同,包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统(杆状病毒)哺乳动物细胞蛋白表达系统,具备多种融合技术,可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。

    生物素连接酶是由大肠杆菌BirA基因编码的双功能蛋白,能识别蛋白质分子的特异序列,使得生物素结合到蛋白质上,同时也可以作为一种阻遏蛋白对合成生物素的操纵子产生抑制作用。Avi-Tag在体内或体外都能被生物素连接酶在赖氨酸残基连接上一个生物素,从而实现蛋白的生物素化,该标记过程为酶促反应,具有高效、位点特异及操作方便等特点,同时由于Avi-Tag序列短小,对目的蛋白的构象及活性影响极低,因此该技术被广泛用于蛋白纯化、相互作用筛选和蛋白荧光标记等诸多领域。

    3、基于Avi-Tag技术的生物素化标记和纯化研究

    有研究者建立了基于Avi-Tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化、纯化和检测方法[1],研究者分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGFP和pQCXIH-BirA共转染人胚肾293T细胞,12 h后观察Avi-tag标签对eGFP蛋白在细胞内定位的影响;48 h后裂解细胞,用链霉亲和素珠子纯化生物素标记的eGFP,SDS-PAGE观察eGFP纯化和富集情况,并优化基于Western印迹的生物素化eGFP检测方法。研究者最后建立了基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化标记、纯化与检测方法,为该方法的广泛应用奠定了前期技术基础。

    4、Avi-Tag作为蛋白表达纯化的标签的特点

    Avi-Tag除了可以用于蛋白分离和蛋白纯化之外,还可以用于蛋白质相互作用的研究。

    (1)生物素AviTag只有15个氨基酸,对蛋白空间结构的影响非常小;

    (2)无论在体外或者体内,几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi Tag位点轻易且有效地被生物素化。

    (3)生物素化是通过酶和底物的反应来实现,反应条件相当温和而且标记的专一性极高。

    总之Avi-tag技术作为一种重组蛋白表达纯化的标签,在重组蛋白生产中的作用巨大,是的各种重组蛋白表达和纯化得以事项。除了Avi-tag之外,还有其他的重组蛋白标签,可以根据不同的实验目的,选择合适的蛋白标签,用于蛋白表达纯化研究。

    [1] 基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化、纯化和检测方法[J].

    临床药师网,伴你一起成长!微信公众号:clinphar2007

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    cry
    还木有人打赏~
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